المعاير الحرارية (ITC) هو طريقة مختبرية تقيس الحرارة المنبعثة أو الممتصة أثناء التفاعل الكيميائي ، مثل ارتباط مركب دوائي بجزيء كبير. تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية واكتشاف الأدوية ، حيث يمكن أن توفر معلومات حول الديناميكا الحرارية والحركية والقياس الكيميائي للتفاعل. في هذا المقال ، سأشرح المبادئ الأساسية للمعايرة الحرارية ، والتحديات والتطورات في هذا المجال ، وتطبيقاته في مختلف المجالات.
يمكن اعتبار المعاير الحرارية طريقة مباشرة ت لدراسة التفاعلات الجزيئية ، والتي لا تتطلب أي فصل أو تجميد للمواد المتفاعلة. يعتمد مبدأ المعاير الحرارية على القانون الأول للديناميكا الحرارية ، والذي ينص على أن تغير الطاقة في النظام يساوي التبادل الحراري مع المناطق المحيطة. يتناسب التبادل الحراري مع تغير الإنثالبي في التفاعل ، وهو ما يعكس قوة ونوع التفاعلات بين المتفاعلات. يمكن أن يكون تغير الإنثالبي موجبا (ماص للحرارة) أو سلبيا (طاردا للحرارة) ، اعتمادا على ما إذا كان التفاعل يمتص الحرارة أو يطلقها.
تتضمن المعاير الحرارية مكونين رئيسيين: خلية عينة وخلية مرجعية. تحتوي خلية العينة على أحد المتفاعلات (عادة الجزيء الكبير) ، بينما تحتوي الخلية المرجعية على المذيب فقط. يتم الحفاظ على الخليتين عند درجة حرارة ثابتة بواسطة آلية التغذية المرتدة. يتم حقن كمية صغيرة من المتفاعل الآخر (عادة المركب الدوائي) في خلية العينة على فترات منتظمة ، بينما يتم حقن حجم متساو من المذيب في الخلية المرجعية. يسبب الحقن فرقا في درجة الحرارة بين الخليتين ، والذي يتم قياسه بواسطة كاشف حساس. يتناسب الفرق في درجة الحرارة مع الحرارة المنبعثة أو التي يمتصها التفاعل في خلية العينة. يتم رسم إشارة الحرارة مقابل الوقت أو ضد النسبة المولية للمركب الدوائي إلى الجزيء الكبير ، مما ينتج عنه منحنى المعايرة.
يمكن أن يوفر منحنى المعايرة الحرارية أو isotherm عوامل مختلفة تميز التفاعل ، مثل:
• ثابت الربط (K): تقيس هذه القيمة مدى إحكام ارتباط المركب الدوائي بالجزيء الكبير. يمكن حسابه من شكل وميل منحنى المعايرة الحرارية أو متساوي الحرارة.
• المحتوى الحراري المرتبط (∆H): تقيس هذه القيمة مقدار الحرارة المنبعثة أو التي يمتصها التفاعل. يمكن حسابه من ارتفاع الذروة أو مساحة كل حقنة في منحنى المعايرة الحرارية.
• إنتروبيا الربط (∆S): تقيس هذه القيمة مقدار الاضطراب أو النظام الناتج عن التفاعل. يمكن حسابه من العلاقة بين ∆H ودرجة الحرارة (ΔT) ، باستخدام معادلة جيبس للطاقة الحرة: ∆G = ∆H – T∆S.
• القياس الكيميائي للربط (n): تقيس هذه القيمة عدد جزيئات المركب الدوائي المرتبطة بكل جزيء كبير. يمكن حسابه من نقطة التشبع أو هضبة منحنى المعايرة الحرارية أو متساوي الحرارة.
• حركية الربط (k_on و k_off): تقيس هذه القيم مدى سرعة ارتباط المركب الدوائي بالجزيء الكبير وانفصاله عنه. يمكن حسابها من شكل وعرض كل حقنة في منحنى المعايرة الحرارية.
لدى المعايرة الحرارية العديد من التطبيقات في مختلف المجالات مثل:
• ربط البروتين بالمركب الكيميائي الدوائي: هذه هي عملية دراسة كيفية ارتباط جزيء صغير بمستقبل البروتين أو الإنزيم. يمكن أن تساعد المعايرة الحرارية في تحديد نوع الارتباط ، والمحتوى الحراري ، والانتروبيا ، والقياس الكيميائي ، وآلية تفاعلات البروتين والمركب الدوائي.
• ارتباط البروتين بالبروتين: هذه هي عملية دراسة كيفية تفاعل اثنين أو أكثر من البروتينات مع بعضها البعض. يمكن أن تساعد المعايرة الحرارية في توصيف الديناميكا الحرارية وحركية تفاعلات البروتين والبروتين ، مثل dimerization ، oligomerization ، التكوين المعقد ، إلخ.
• ارتباط البروتين بالحمض النووي: هذه هي عملية دراسة كيفية ارتباط البروتين بتسلسل أو بنية الحمض النووي. يمكن أن تساعد المعايرة الحرارية في توضيح خصوصية الارتباط والتغيرات التوافقية وتنظيم تفاعلات البروتين والحمض النووي.
• تحفيز الإنزيم: هذه هي عملية دراسة كيفية تحفيز الإنزيم لتفاعل كيميائي يتضمن ركيزة أومنتجا. يمكن أن تساعد المعايرة الحرارية في قياس نشاط الإنزيم ، والحركية ، والتثبيط ، والتنشيط ، وآلية تحفيز الإنزيم.
تعد المعايرة الحرارية أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية ولكن لديها أيضا بعض القيود والتحديات. مثل:
• استهلاك العينة: يعتمد استهلاك عينة المعايرة الحرارية على عدة عوامل مثل تركيز العينة ، قوة الارتباط ، وحجم الخلية ، وحجم الحقن ، إلخ. قد تتطلب المعايرة الحرارية كميات كبيرة نسبيا من العينات خاصة بالنسبة للأنظمة منخفضة الوزن الجزيئي. لذلك من المهم تحسين إعداد العينة والتصميم التجريبي لتقليل استهلاك العينة.
• تفسير البيانات: يتطلب تفسير البيانات في المعايرة الحرارية خبرة ، حيث انه قد توفر المعايرة الحرارية بيانات غامضة متضاربة وغير كاملة. لذلك من المهم استخدام طرق ومصادر تكميلية للتحقق من صحة نتائج المعايرة الحرارية وصقلها.
في الختام ، تعد المعايرة الحرارية طريقة مفيدة ومتعددة الاستخدامات لدراسة التفاعلات الجزيئية ولكنها تتطلب أيضا تطبيقا وتفسيرا دقيقا ونقديا.
المصادر:
- Freyer, M. W., & Lewis, E. A. (2008). Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology, 84, 79-113
- Velazquez-Campoy, A., & Freire, E. (2006). Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols, 1(1), 186-191
- Leavitt, S., & Freire, E. (2001). Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology, 11(5), 560-566
- Ladbury, J. E., & Doyle, M. L. (2004). Biocalorimetry 2: applications of calorimetry in the biological sciences. John Wiley & Sons